Na czym polega diagnostyka pasożytów metodą PCR?

Wykrywanie patogenów wywołujących choroby pasożytnicze przeszło w ostatnich latach drogę od żmudnych obserwacji mikroskopowych do precyzyjnych analiz na poziomie DNA. Tradycyjne metody, choć wciąż użyteczne, bywają zawodne przy małej liczbie pasożytów lub w specyficznych fazach ich rozwoju. Rozwój biologii molekularnej pozwolił na stworzenie narzędzi, które identyfikują obecność niechcianych lokatorów nie na podstawie ich wyglądu, lecz unikalnego zapisu genetycznego. Warto zrozumieć, jak w praktyce działa metodologia PCR badań na pasożyty w organizmie i w jakich sytuacjach daje lepsze rezultaty niż standardowe testy kału czy krwi. Poniżej przedstawiamy najważniejsze informacje na ten temat. Zachęcamy do lektury!

Metody wykorzystywane w badaniach na pasożyty w organizmie

Współczesna parazytologia korzysta z kilku grup testów, które różnią się sposobem poszukiwania patogenów w pobranym materiale.

Mikroskopia to od dekad podstawowy sposób wykrywania pasożytów w przewodzie pokarmowym. Badanie kału polega na uważnym oglądaniu próbek w powiększeniu w celu znalezienia jaj robaków, cyst pierwotniaków czy ich aktywnych form, czyli trofozoitów. Choć metoda ta jest powszechnie dostępna, jej rzetelność bywa ograniczona przez cykl życia pasożyta i moment pobrania materiału. Wynik zależy w dużej mierze od wprawionego oka laboranta oraz od tego, czy w danej chwili patogeny w ogóle są wydalane z organizmu.

Testy serologiczne, takie jak ELISA czy Western blot, działają w inny sposób. Nie polegają na poszukiwaniu samego pasożyta, lecz śladów jego obecności w układzie odpornościowym. Badania te wykrywają swoiste przeciwciała, które organizm wytwarza po zetknięciu się z antygenami patogenu. Trzeba jednak pamiętać, że obecność immunoglobulin we krwi potwierdza jedynie kontakt z pasożytem, a niekoniecznie trwającą właśnie infekcję. Przeciwciała potrafią krążyć w ciele jeszcze długo po udanym leczeniu, co utrudnia jednoznaczną ocenę aktualnego stanu zdrowia.

Rozwiązania molekularne w zakresie badań na pasożyty w organizmie to obecnie najbardziej precyzyjne narzędzia w rękach parazytologów. Analizy oparte na genetyce skupiają się na odnalezieniu konkretnych fragmentów DNA patogenu, co całkowicie zmienia sposób diagnozowania. Najpopularniejszą z tych metod jest reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR, która stała się punktem odniesienia w wykrywaniu wielu trudnych do zdiagnozowania infekcji.

Na czym polega diagnostyka pasożytów metodą PCR?

PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) to metoda pozwalająca na precyzyjne rozpoznanie gatunku pasożyta poprzez analizę jego unikalnego zapisu genetycznego. Mechanizm opiera się na amplifikacji, czyli wielokrotnym namnażaniu konkretnych fragmentów kwasów nukleinowych w warunkach laboratoryjnych. Każdy pasożyt ma unikalny układ DNA lub RNA, który służy jako jego genetyczny odcisk palca. Metoda daje sposobność wykrycia tych śladów, nawet jeśli w pobranym materiale znajduje się ich znikoma ilość. Można to porównać do odnalezienia jednego zdania w ogromnej bibliotece i powielenia go tyle razy, aż stanie się widoczne gołym okiem. Po zakończeniu całego procesu liczba kopii poszukiwanego genu jest tak duża, że badacz zyskuje pewność co do obecności patogenu, nawet jeśli na początku w próbce było zaledwie kilka cząsteczek DNA.

Za bardzo wysoką precyzję testu odpowiadają startery, zwane też primerami. Są to krótkie nici DNA, które potrafią dopasować się wyłącznie do genów konkretnego gatunku pasożyta, ignorując DNA człowieka czy innych mikroorganizmów. Dzięki temu proces kopiowania zaczyna się tylko wtedy, gdy w próbce rzeczywiście znajduje się poszukiwany patogen. Wysoka czułość sprawia, że badanie wykrywa infekcję na bardzo wczesnym etapie lub przy małej liczbie patogenów.

Przebieg badania PCR na pasożyty: od pobrania próbki do wyniku

Cały proces zaczyna się od dostarczenia do laboratorium właściwego materiału biologicznego. To, co zostanie poddane analizie, zależy bezpośrednio od objawów chorobowych pacjenta oraz miejsca, w którym mogą bytować pasożyty. Jeśli lekarz podejrzewa ich obecność w układzie pokarmowym, najczęściej bada się próbkę kału. W przypadku patogenów bytujących we krwi lub narządach wewnętrznych konieczne jest pobranie krwi żylnej, zazwyczaj z żyły łokciowej. Zdarza się też, że do analizy trafia mocz, wymazy z gardła lub nosa, a niekiedy nawet drobne fragmenty tkanek. Bardzo ważne jest to, aby materiał trafił do laboratorium szybko i w odpowiedniej temperaturze, najlepiej chłodniczej. Takie warunki chronią DNA przed uszkodzeniem, co mogłoby zafałszować ostateczny wynik analizy.

Praca w laboratorium zaczyna się od izolacji DNA lub RNA z otrzymanej próbki, co nazywa się ekstrakcją. Etap ten polega na użyciu preparatów, które rozbijają komórki pasożyta i uwalniają jego geny, jednocześnie usuwając zanieczyszczenia mogące zakłócić dalsze kroki. Tak przygotowany materiał trafia do termocyklera. Cały proces polega na wielokrotnym powtarzaniu cykli w temperaturze od 60°C do 94°C. Każdy taki skok ciepła ma inne zadanie: najpierw rozdziela nici DNA, potem pozwala na przyłączenie się starterów, a na końcu umożliwia budowę nowych kopii poszukiwanego genu.

Ostatni etap polega na analizie namnożonych fragmentów i ich dokładnym policzeniu. Badania PCR na pasożyty w organizmie, przeprowadzane w czasie rzeczywistym, pozwalają śledzić ten proces na bieżąco i określić, jak dużo patogenów znajduje się w organizmie pacjenta. Na wyniki z laboratorium czeka się przeważnie od 2 do 5 dni roboczych. Określają one, czy w próbce wykryto DNA patogenów, a jeśli tak – wskazuje konkretną nazwę gatunkową znalezionego intruza.

Jakie pasożyty można wykryć za pomocą metody PCR?

Lista organizmów, które można zidentyfikować tą metodą, jest długa – od popularnych w naszym klimacie pasożytów układu pokarmowego, aż po gatunki egzotyczne.

Pasożyty układu pokarmowego

Testy molekularne bezbłędnie rozpoznają pierwotniaki, takie jak lamblia jelitowa (Giardia lamblia) czy pełzak czerwonki (Entamoeba histolytica). Diagnostyka obejmuje także kryptosporydia oraz Blastocystis hominis, których obecność często budzi wątpliwości diagnostyczne. Metoda ta świetnie radzi sobie również z wykrywaniem nicieni (owsika, glisty ludzkiej, włosogłówki) oraz różnych rodzajów tasiemców, w tym uzbrojonego i nieuzbrojonego.

Patogeny krwi i tkanek

Metoda PCR jest niezastąpiona przy poszukiwaniu zarodźców malarii (Plasmodium spp.) oraz pierwotniaków Toxoplasma gondii, wywołujących toksoplazmozę. Pozwala również na wykrycie pasożytów tkankowych, takich jak włosień kręty czy larwy Toxocara, które trudno uchwycić w tradycyjnym badaniu kału. Dzięki analizie DNA można potwierdzić zakażenie nawet wtedy, gdy pasożyty nie krążą bezpośrednio w krwiobiegu w dużej liczbie.

Panele typu multipleks

Wiele placówek laboratoryjnych ma w swojej ofercie obecnie zbiorcze testy, które w ramach jednej analizy szukają DNA kilkunastu różnych gatunków naraz. To bardzo ułatwia diagnozę osób wracających z egzotycznych podróży, które mogły mieć kontakt z patogenami niespotykanymi w Polsce. Taka zbiorcza diagnostyka oszczędza czas i pozwala na szybsze wdrożenie celowanego leczenia, zamiast wykonywania wielu pojedynczych testów.

Jak wygląda przygotowanie do badania PCR na pasożyty?

Przygotowanie do testu genetycznego w ramach badania na pasożyty w organizmie nie jest skomplikowane. Najważniejszą kwestię stanowi zachowanie odpowiedniej przerwy po ewentualnym przyjęciu leków przeciwpasożytniczych. Środki te mogą całkowicie wybić patogeny lub ograniczyć ich ilość, co sprawi, że test DNA da wynik ujemny mimo trwającej infekcji. Przyjmuje się, że od ostatniej dawki leku do momentu pobrania próbki powinny minąć co najmniej 2 do 4 tygodni. Podobna zasada dotyczy silnych antybiotyków, dlatego o wszystkich przyjmowanych preparatach należy wcześniej poinformować lekarza zlecającego badanie.

Ponadto przy pobieraniu próbki kału w domu, którą należy umieścić w jałowym pojemniku z apteki, trzeba uważać, by do środka nie dostała się woda z toalety ani mocz. Wystarczy porcja odpowiadająca wielkością orzechowi włoskiemu, chyba że laboratorium wydało inne instrukcje. Materiał najlepiej dostarczyć do placówki jeszcze tego samego dnia, a do tego czasu trzymać ją w lodówce. Jeśli badanie dotyczy pasożytów krwi, procedura wygląda tak samo, jak przy zwykłej morfologii i odbywa się w gabinecie zabiegowym. Co ważne, w przypadku większości testów DNA nie trzeba być na czczo.

Kiedy warto wykonać badanie PCR na pasożyty?

Nawracające problemy z żołądkiem czy jelitami to wyraźny sygnał, żeby udać się do specjalisty. Najczęstsze powody, dla których lekarze decydują się na zlecenie badań na pasożyty w organizmie, to:

• przewlekłe biegunki,
• bóle brzucha,
• częste wzdęcia,
• nagły spadek wagi bez wyraźnej przyczyny,
• ciągłe zmęczenie,
• anemię,
• niedobory witamin mimo zdrowej diety.

Ryzyko zakażenia rośnie też w konkretnych okolicznościach, takich jak powrót z wakacji w tropikach, picie wody z niepewnego źródła czy częsty kontakt ze zwierzętami. Testy DNA są też niezastąpione, gdy chcemy upewnić się o powodzeniu terapii lub gdy pracujemy w zawodzie związanym z narażeniem na kontakt z patogenami, np. jako weterynarz czy pracownik gastronomii.

Co wyróżnia badania PCR na pasożyty na tle innych metod?

Badania PCR na pasożyty w Helisalab wykrywają patogeny w ponad 95% przypadków, natomiast zwykła analiza próbki kału miewa skuteczność na poziomie zaledwie 30-60%, zwłaszcza przy mniej nasilonych infekcjach. Testy DNA pozwalają też bezbłędnie odróżnić od siebie gatunki, które pod mikroskopem wyglądają niemal identycznie. Mimo to tradycyjne badania wciąż mają swoje zalety i są potrzebne w medycynie. Tylko mikroskop pozwala ocenić, jak dużo pasożytów znajduje się w próbce oraz czy są one żywe. Takie działanie nadal uznaje się za wzorzec przy monitorowaniu niektórych chorób tropikalnych.

materiały partnera (lh)